蜂蜜作為營(yíng)養(yǎng)豐富的天然食品和保健品，深受全球消費(fèi)者喜愛(ài)，但它卻是一種極易摻假的食品，因此，研究蜂蜜真?zhèn)舞b別技術(shù)長(zhǎng)期深受關(guān)注。本文介紹了近20年來(lái)國(guó)內(nèi)外蜂蜜質(zhì)量控制研究進(jìn)展，以及蜂蜜真實(shí)性研究方法和鑒別技術(shù)。綜合分析認(rèn)為，現(xiàn)有蜂蜜檢測(cè)技術(shù)在一定程度上能夠有效鑒別蜂蜜真?zhèn)?，有利于蜂蜜質(zhì)量控制，但存在所需儀器價(jià)格昂貴、操作復(fù)雜、檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、需要檢測(cè)人員有專業(yè)背景、操作地點(diǎn)固定等缺陷；同時(shí)，現(xiàn)有蜂蜜鑒別分析技術(shù)常常落后于摻假技術(shù)，難以杜絕蜂蜜摻假。因此，有必要研發(fā)主要針對(duì)蜂蜜內(nèi)源性特有成分，而不是依賴外源添加物質(zhì)的分析鑒別新技術(shù)。近年來(lái)，基于基因組學(xué)、蛋白組學(xué)的生物標(biāo)志物研究在相關(guān)領(lǐng)域的應(yīng)用非常普遍，但尚未見(jiàn)基于相關(guān)組學(xué)技術(shù)應(yīng)用于蜂蜜真?zhèn)魏突坭b別的研究報(bào)道中。因此，研究開(kāi)發(fā)基于蜂蜜特征標(biāo)志物的快速檢測(cè)新技術(shù)——免疫膠體金層析試紙條或試劑盒檢測(cè)，將是今后蜂蜜質(zhì)量控制及真?zhèn)舞b別技術(shù)的主要發(fā)展方向。
蜂蜜是由蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露，與自身分泌物結(jié)合后，經(jīng)充分釀造而形成的，因其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，適用人群廣泛，受到越來(lái)越多的消費(fèi)者喜愛(ài)。作為一種天然的甜味物質(zhì)，蜂蜜中含量最豐富的是糖和水分，其中糖類主要是果糖和葡萄糖，此外，蜂蜜中還含有機(jī)酸、酶和來(lái)源于蜜蜂采集的植物花粉等固體顆粒物。根據(jù)蜜源植物來(lái)源的不同，天然蜂蜜分為單花蜜和雜花蜜。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)對(duì)蜂蜜的需求量持續(xù)増加。中國(guó)養(yǎng)蜂學(xué)會(huì)的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，我國(guó)2015年蜂蜜年產(chǎn)量約46.82萬(wàn)t、蜂王漿年產(chǎn)量3500t、蜂花粉年貿(mào)易量5000t、蜂膠年產(chǎn)量450t、蜂蠟?zāi)戤a(chǎn)量6000t，年產(chǎn)值約200億元，創(chuàng)造了巨大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。然而，我國(guó)市場(chǎng)上的假蜂蜜問(wèn)題卻非常嚴(yán)重，以2015年統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)為例，全國(guó)蜂蜜年產(chǎn)量為46.82萬(wàn)t，系世界之首，去除出口14.18萬(wàn)t，內(nèi)銷應(yīng)為32.64萬(wàn)t，但蜂蜜實(shí)際市場(chǎng)銷量卻超過(guò)100萬(wàn)t，顯然很多蜜不是真蜜。實(shí)際上，蜂蜜摻假摻雜是國(guó)內(nèi)長(zhǎng)期且普遍存在的問(wèn)題。近年來(lái)，蜂蜜摻假摻雜原料越來(lái)越精細(xì)，摻假手段越來(lái)越高明，由最初的蔗糖、轉(zhuǎn)化糖、飴糖、羧甲基纖維素、糊精或淀粉類等物質(zhì)摻假，到目前的在蜂蜜中摻入高果糖玉米糖漿、甘蔗糖漿、果葡糖漿、甜菜糖漿、大米糖漿等，通過(guò)傳統(tǒng)的感官分析己很難鑒別蜂蜜是否摻假。長(zhǎng)此以往，摻假摻雜將對(duì)蜂蜜產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展造成嚴(yán)重影響。
雖然在《蜂蜜》(GH/T 18796—2012)“真實(shí)性要求”中明確指出，“蜂蜜中不得添加任何當(dāng)前明確或不明確的添加物”。但因?yàn)楝F(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)技術(shù)的缺陷，不足以應(yīng)對(duì)新出現(xiàn)的蜂蜜質(zhì)量問(wèn)題，消費(fèi)者更難以識(shí)別真假蜂蜜。同時(shí)，蜂蜜造假嚴(yán)重影響了我國(guó)蜂蜜在國(guó)際市場(chǎng)上的質(zhì)量信譽(yù)和市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力，因此，加快蜂蜜的真?zhèn)舞b定和質(zhì)量控制技術(shù)研究日顯重要。
1 蜂蜜的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)
和其他食品一樣，蜂蜜質(zhì)量也必須按照可靠的標(biāo)準(zhǔn)，通過(guò)物理、化學(xué)和生化參數(shù)對(duì)其進(jìn)行客觀評(píng)價(jià)。國(guó)際上很多相關(guān)組織和國(guó)家制定了蜂蜜質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，我國(guó)和歐盟對(duì)蜂蜜相關(guān)成分指標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定如表1、2所示。從中可知，我國(guó)和歐盟在果糖和葡萄糖、蔗糖、水分、羧甲基糠酸(hydroxy-ethylfurfural， HMF)這4項(xiàng)指標(biāo)上的標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定完全相同，而酸度、淀粉酶活性指標(biāo)則不同，雖然這2類標(biāo)準(zhǔn)都未規(guī)定蛋白質(zhì)含量，但作為蜂蜜的固有營(yíng)養(yǎng)成分之一，也應(yīng)將其列入質(zhì)量控制指標(biāo)；如僅檢測(cè)以上常規(guī)指標(biāo)往往難以應(yīng)對(duì)多種多樣的添加物，無(wú)法達(dá)到鑒別蜂蜜真?zhèn)蔚哪康摹?/span>
2 蜂蜜摻假方式
蜂蜜摻假分為直接摻假和間接摻假。直接摻假就是在蜂蜜中添加外源物質(zhì)，間接摻假則是在蜜蜂自然產(chǎn)卵階段對(duì)其喂食工業(yè)糖漿。相比之下，間接摻假更加難以檢測(cè)。目前，常見(jiàn)的蜂蜜直接摻假方式主要有以下幾種:1)人工蜜。顧名思義是完全通過(guò)人為加工而成，如以糖漿代替花蜜，沒(méi)有任何天然蜂蜜成分，目前，此摻假手段己越來(lái)越少見(jiàn)。2)以低價(jià)蜜充高價(jià)蜜。蜜蜂采集同一類植物花蜜釀成的蜂蜜為單花蜜，其口感、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值比雜花蜜高，因此其市場(chǎng)價(jià)格高于雜花蜜。目前相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)尚未對(duì)單一蜜源蜂蜜純度作明確要求，況且地域及季節(jié)不同的同種單花蜜質(zhì)量差別也很大，因此，給不法商販以可乘之機(jī)。3)添加外源糖漿是目前最常見(jiàn)的蜂蜜摻假手段。天然蜂蜜的主要成分為糖，因此不法商販往往在蜂蜜中加入如高果糖玉米糖漿等轉(zhuǎn)化糖或糖漿及糖類代用品。由于蜂蜜中的果糖和葡萄糖比例與添加的糖漿中的比例很相似，即使摻入這些糖漿，摻假蜂蜜的各項(xiàng)指標(biāo)也完全符合現(xiàn)有國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，因此這些技術(shù)性摻假給蜂蜜的真實(shí)性檢測(cè)帶來(lái)了極大困難。
3 蜂蜜摻假分析法
根據(jù)蜂蜜和高果糖漿中高寡糖的不同，常采用高效液相色譜技術(shù)(high-performance liquid chromatography， HPLC)檢測(cè)蜂蜜中是否摻有C4、C3植物高果糖漿。通常是用水將檢測(cè)的蜂蜜樣品溶解，然后直接上樣至C18固相萃取柱凈化，用甲醇洗脫，建立反相色譜快速檢測(cè)蜂蜜中大米糖漿含量的方法。蜂蜜中摻假大米糖漿的HPLC方法的檢出限為20mg/mL，在50~200mg/g范圍內(nèi)線性關(guān)系較好。用HPLC分析摻假蜂蜜發(fā)現(xiàn)，淀粉糖漿在15.25min的保留時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)糖漿指標(biāo)峰值，而純蜂蜜在同樣的保留時(shí)間內(nèi)未發(fā)現(xiàn)該指標(biāo)峰；此外，將這種檢測(cè)蜂蜜中摻假淀粉糖漿的HPLC方法應(yīng)用于100多個(gè)商業(yè)蜂蜜的真實(shí)性檢驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，該方法提高了蜂蜜摻假檢測(cè)的準(zhǔn)確度?？傊?，HPLC能同時(shí)連續(xù)分析大量樣品，并且能避免樣品間的相互影響，但由于樣品的檢測(cè)限易受到基質(zhì)效應(yīng)影響，所以采用更高色譜分辨率的超高壓液相色譜技術(shù)(UHPLC)將是未來(lái)的發(fā)展趨勢(shì)。
氣相色譜法及氣相色譜-質(zhì)譜法
通過(guò)氣相色譜法(gas chromatography， GC)或氣相色譜-質(zhì)譜法(gas chromatography-mass spectrometry， GC-MS)可以高靈敏地檢測(cè)蜂蜜或糖漿中的糖組分，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)糖漿中特征組分，為蜂蜜摻假鑒定提供依據(jù)。RUIZ-MATURE等建立了用于蜂蜜中外源糖漿檢測(cè)的GC-MS方法，先后發(fā)現(xiàn)雙果糖苷(difructose anhydrides， DFAs)和菊粉三糖(inulotriose)分別是工業(yè)糖漿和菊粉糖漿的特征標(biāo)志物，對(duì)于蜂蜜中摻入這些糖漿的檢出限可達(dá)到5%。通過(guò)氣相色譜和液相色譜聯(lián)合的方法對(duì)蜂蜜中糖分進(jìn)行分析，獲得了樣品中糖組分的指紋圖譜，然后通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析來(lái)檢測(cè)樣品中摻入的外源糖漿，檢出限可達(dá)到10%。
光譜法
近紅外光譜法
近紅外光譜技術(shù)(near infrared spectroscopy， NIR)作為一種比較成熟的光譜技術(shù)，在蜂蜜內(nèi)部品質(zhì)檢測(cè)及摻假判別，以及在蜂蜜的產(chǎn)地和植物源判別上取得了一些成果。用NIR定性和定量檢測(cè)摻入蜂蜜中的高果糖玉米糖漿和麥芽糖漿，可通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性自適應(yīng)重加權(quán)抽樣(competitive adaptive reweighted sampling， CARS)來(lái)選擇關(guān)鍵變量，用偏最小二乘法結(jié)合線性判別分析(partial least square method combined with linear discriminant analysis， PLS-LDA)對(duì)摻假蜂蜜樣品進(jìn)行分類，并用偏最小二乘回歸(partial least-squares regression， PLSR)來(lái)預(yù)測(cè)蜂蜜摻假的程度。用CARS-PLS-LDA模型研究的結(jié)果顯示:對(duì)真蜂蜜與摻高果玉米糖漿蜂蜜的判別精確度為86.3%，而對(duì)真蜂蜜與摻麥芽糖漿蜂蜜的判別精確度為96.1%； NIR結(jié)合PLSR法不能對(duì)摻雜的高果玉米糖漿進(jìn)行定量分析，但可以對(duì)摻雜的麥芽糖漿進(jìn)行定量分析。用NIR檢測(cè)不同果糖和葡萄糖的摻比，并結(jié)合PLSR、k-近鄰k-NN)和SIMCA軟件方法分析數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)PLSR分析法的準(zhǔn)確率最高。因而，MOUAZEN等采用NIR結(jié)合PLSR檢測(cè)了摻入不同葡萄糖漿濃度的沙特阿拉伯蜂蜜和進(jìn)口蜂蜜樣品摻假情況。張妍楠等通過(guò)NIR結(jié)合主成分分析(principal component analysis， PCA)典型判別分析方法對(duì)洋槐蜜中摻入的大米糖漿進(jìn)行了鑒別，結(jié)果顯示，所檢測(cè)的121個(gè)樣品均得到準(zhǔn)確判別，準(zhǔn)確率為100‰這些研究表明，NIR結(jié)合多元數(shù)據(jù)分析能夠有效檢測(cè)蜂蜜摻假，具有即時(shí)、無(wú)損檢測(cè)等特點(diǎn)。
熒光光譜法
趙杰文等用三維熒光光譜技術(shù)來(lái)鑒別蜂蜜中摻雜的大米糖漿，其中光譜信息量采用特征參量法和PCA進(jìn)行壓縮提取，而數(shù)據(jù)則采用線性判別分析法(LDA)和誤差反向傳播人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)法(back propagation-artificial neural network， BP-ANN)進(jìn)行分析，結(jié)果4個(gè)主成分的預(yù)測(cè)集樣本在蜂蜜摻假的鑒別試驗(yàn)中最易被模型識(shí)別，此時(shí)，LDA和BP-ANN的模型識(shí)別率分別為94.44%和100%，表明三維熒光光譜結(jié)合BP-ANN模型能夠更加有效地鑒別蜂蜜中大米糖漿摻假。
傅里葉變換紅外光譜法
傅里葉變換紅外光譜法提供了一種快速、無(wú)損替代化學(xué)測(cè)量的定性技術(shù)，可在指紋區(qū)較窄的頻帶減少重疊的問(wèn)題，允許采用一些簡(jiǎn)單的數(shù)學(xué)處理，如峰高或直接繪制濃度區(qū)域。用衰減全反射傅里葉變換紅外光譜法(attenuated total reflection Fourier transform infrared spectrum， ATR-FTIR)結(jié)合多元方法可鑒別蜂蜜中摻假標(biāo)準(zhǔn)糖溶液或糖漿，用二維和三維PCA評(píng)分圖可確定摻假蜂蜜類型，并對(duì)純蜂蜜和摻假(0~100%)蜂蜜樣品進(jìn)行分析。用ATR-FTIR鑒別蜂蜜中蔗糖、葡萄糖、果葡糖漿的摻假，其中，主要通過(guò)特征吸收峰來(lái)判定摻入的葡萄糖和蔗糖，通過(guò)計(jì)算軟件處理紅外圖譜，再通過(guò)比較二階導(dǎo)數(shù)圖譜在1054、817cm-1處的吸收峰來(lái)判定蜂蜜中摻入的果葡糖漿的量；結(jié)果顯示，該方法對(duì)摻入蜂蜜中的3種物質(zhì)的最小檢出限量為10%。用FTIR檢測(cè)蜂蜜中糖漿摻假，將光譜數(shù)據(jù)用PCA壓縮、摻假蜂蜜樣品用LDA和典型變量技術(shù)鑒別，結(jié)果顯示，用典型變量技術(shù)鑒別摻玉米糖漿和糖的混合物、用線性判別分析鑒別摻蔗糖和玉米糖漿的蜂蜜樣品的準(zhǔn)確率分別為100%和90%。
碳同位素法
同位素比值分析法
穩(wěn)定性碳同位素比率法(stable carbon isotope ratio method， SCIRA)，其依據(jù)是所有蜜源植物都屬于C3植物，我國(guó)規(guī)定要求采用SCIRA檢測(cè)摻入蜂蜜中的C4植物糖含量，對(duì)蜂蜜真實(shí)性進(jìn)行鑒定。SOUZA-KRULISKI等用SCIRA分析巴西南部和東南部地區(qū)的商品蜂蜜，將天然蜂蜜的同位素值δ13C與各自的內(nèi)標(biāo)蛋白比較，若樣品的蜂蜜蛋白與內(nèi)標(biāo)蛋白的同位素值之間的差≦—1‰，則被認(rèn)為是摻假，結(jié)果表明，在分析的61個(gè)樣品中摻假的蜂蜜比例為18%，表明SCIRA能有效地識(shí)別和量化商業(yè)蜂蜜摻假。GULER等分析了100個(gè)純蜂蜜和摻不同量商業(yè)糖漿的樣品蜂蜜及其蛋白質(zhì)的δ13C值，以及蜂蜜和蛋白質(zhì)的δ13C值之間的差值Δδ13C和C4%糖的比，結(jié)果顯示，當(dāng)高果玉米糖漿的含量増加時(shí)，低含量的糖漿摻假可以更容易地被檢測(cè)出，其中蜂蜜的C4%糖分析(AOAC 998.12)能更有效地檢測(cè)摻假；但也發(fā)現(xiàn)內(nèi)標(biāo)碳同位素比值分析法不能有效地檢測(cè)間接蜂蜜摻假，即喂食蜜蜂產(chǎn)自C3植物的糖漿如甜菜和小麥糖漿?？傊琒CIRA是檢測(cè)蜂蜜摻假的標(biāo)準(zhǔn)方法，但相比于NIR等方法，存在耗時(shí)長(zhǎng)、檢測(cè)范圍窄及準(zhǔn)確度低等缺點(diǎn)，促使越來(lái)越多的研究者尋求更加高效的方法來(lái)檢測(cè)蜂蜜摻假。
SIMSEK等用元素分析儀-穩(wěn)定同位素比率質(zhì)譜儀(element analyser-stable isotope ratio mass spectrometry， EA-IRMS)分析31份來(lái)自土耳其不同植物來(lái)源、地區(qū)的蜂蜜樣品的13C/12C及43個(gè)商品蜂蜜的摻假情況，結(jié)果顯示，土耳其蜂蜜和蛋白質(zhì)組分的13C/12C值的范圍分別為-27.58‰~-23.30‰和-26.76‰~-24.13‰，商品蜜的13C/12C值范圍分別為-25.54‰~-11.28‰和-25.61‰~-19.35‰，有23%的商品蜜摻假，其中有2個(gè)被檢測(cè)出的摻假蜂蜜樣品甚至只含有糖漿。研究人員認(rèn)為，政府應(yīng)該采取更加嚴(yán)厲的蜂蜜質(zhì)量控制措施。
液相色譜-同位素質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)
眾所周知，很多摻假蜂蜜可用EA-IRMS進(jìn)行真實(shí)性測(cè)試。但有學(xué)者認(rèn)為，蜂蜜的同位素13C/12C比值可以通過(guò)調(diào)整糖的比例或添加糖來(lái)改變，或許摻假蜂蜜反而會(huì)増加。因此，迫切需要改進(jìn)蜂蜜真實(shí)性檢測(cè)和防止蜂蜜摻假分析方法。采用液相色譜(liquid chromatography， LC)-同位素比率質(zhì)譜(IRMS)技術(shù)，可以測(cè)定蜂蜜中果糖、葡萄糖、二糖、三糖等的同位素比，進(jìn)而對(duì)蜂蜜摻假進(jìn)行判定，一般結(jié)合:1)Δδ13C(蛋白質(zhì)-蜂蜜)≧-1.0‰；2)Δδ13C (Fru — Glu)在-1.0‰~1.0‰之間；3)Δδ13Cmax為±2.1‰，即可對(duì)蜂蜜真假進(jìn)行判定。DONG等對(duì)無(wú)法提取出蛋白的蜂蜜樣品采用LC-IRMS技術(shù)進(jìn)行測(cè)試和真實(shí)性判定，結(jié)果顯示，該方法可以作為AOAC 998.12 C4植物糖方法的有效補(bǔ)充。YOO等比較了EA-IRMS及LC-IRMS優(yōu)缺點(diǎn)，并結(jié)合韓國(guó)發(fā)生的蜂蜜摻假案例分析，在經(jīng)過(guò)全面技術(shù)資格測(cè)試后得出，蜂蜜的真實(shí)測(cè)試應(yīng)該采用LC-IRMS方法。此外，采用LC-IRMS還可測(cè)定蜂蜜中γ-淀粉酶殘留量。γ-淀粉酶是大米糖漿生產(chǎn)過(guò)程中酶解大米淀粉的活性物質(zhì)，因此，蜂蜜中是否摻入大米糖漿可以通過(guò)測(cè)定y-淀粉酶殘留量來(lái)進(jìn)行判別。根據(jù)酶解反應(yīng)中γ-淀粉酶可將底物麥芽糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖的特性，可先用凝膠色譜柱將樣品所含的酶與糖預(yù)分離，再用LC分離麥芽糖和葡萄糖，通過(guò)IRMS測(cè)定酶解產(chǎn)物葡萄糖含量來(lái)確定γ-淀粉酶的殘留量。結(jié)果表明，蜂蜜中γ-淀粉酶殘留量的線性范圍為5~200U/kg，定量限為5U/kg。相比于HPLC等方法，LC-IRMS方法具有消耗試劑量少、節(jié)省分析時(shí)間、簡(jiǎn)化操作程序和弱化樣品制備敏感性等優(yōu)點(diǎn)。
差示掃描量熱法
差示掃描量熱法(differential scanning calorimetry， DSC)是通過(guò)測(cè)定純蜂蜜與摻假蜂蜜的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度(Tg)、熔化焓(ΔH)和熱容(ΔCp)等熱力學(xué)參數(shù)來(lái)判斷蜂蜜是否摻假。黃文誠(chéng)用DSC分別測(cè)量從-65~230℃及-65~130℃時(shí)純蜂蜜和純糖漿從低溫到高溫完整的熱行為及摻假蜂蜜的熱行為發(fā)現(xiàn)，用甜菜糖和蔗糖摻假會(huì)使法國(guó)薰衣草蜂蜜等的Tg明顯移位，大大提高熔融熱函。表明用Tg并結(jié)合熔融熱函，有利于定性區(qū)別蜂蜜和糖漿。CORDELLA等發(fā)現(xiàn)，添加糖漿的百分比和Tg具有線性關(guān)系，在40~90℃的溫度范圍內(nèi)，ΔH也有類似的關(guān)系；對(duì)實(shí)際樣品檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，該方法對(duì)蜂蜜摻工業(yè)糖漿的最低檢測(cè)限為5%。說(shuō)明作為熱分析方法的DSC具有檢測(cè)快速、需要樣品量少等優(yōu)點(diǎn)，近年來(lái)被廣泛應(yīng)用于食品摻假分析和質(zhì)量控制中。
蜂蜜蛋白成分和花粉DNA條碼分析法
現(xiàn)有蜂蜜真?zhèn)舞b別和檢測(cè)方法在很大程度上是基于蜂蜜中含量最多的糖類化合物等非特異性成分，尚難從根源上解決蜂蜜摻假的問(wèn)題。為完善真?zhèn)舞b別技術(shù)，還需要分析研究蜂蜜中其他特異性成分。而蜂蜜蛋白質(zhì)是蜂蜜特有的內(nèi)標(biāo)物，根據(jù)蛋白質(zhì)特異性及含量差異分析，可以判斷蜂蜜來(lái)源及是否摻假。蜂蜜蛋白質(zhì)主要來(lái)自蜜蜂及蜜源植物花粉或花蜜，含量一般占蜂蜜總質(zhì)量的0.2%~1.0%。通過(guò)高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用(HPLC-MS-MS)分析發(fā)現(xiàn)，蜂蜜蛋白中含有蜜蜂頭部王漿腺分泌的王漿主蛋白MRJP-1、MRJP-2、MRJP-5和MRJP-7，其中以MRJP-1含量最高。不同蜜源的蜂蜜均含蜜蜂源的MRJP 1~5、抗菌肽defensin-1和α-葡萄糖酶。以MRJP-1作為抗原制備的抗體可應(yīng)用于摻假蜂蜜的酶聯(lián)免疫吸附(enzyme-linked immunosorbent assay， ELISA)快速檢測(cè)。
聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)分析法
周厚報(bào)用十二烷基硫酸鈉聚-丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis， SDS-PAGE)測(cè)定8種不同花源的28個(gè)單花種蜂蜜樣品中的蛋白質(zhì)含量發(fā)現(xiàn)，不同產(chǎn)地的相同花源蜂蜜蛋白質(zhì)組成基本相同，但蜂蜜蛋白質(zhì)含量差異較大；不同花源的單花種蜂蜜的蛋白質(zhì)組成存在差異。NISBET等用SDS-PAGE法檢測(cè)不同植物來(lái)源和喂食蜂群蔗糖產(chǎn)生的蜂蜜的蛋白圖譜發(fā)現(xiàn)，通過(guò)蛋白條帶可以區(qū)分純蜂蜜和摻假蜂蜜。
淀粉酶活性測(cè)定法
來(lái)源不同的蜂蜜淀粉酶活性差異較大，易出現(xiàn)假陽(yáng)性和假陰性結(jié)果，如制假者通過(guò)加入人工淀粉酶的方法提高淀粉酶值，甚至在同工酶譜方面進(jìn)行優(yōu)化，會(huì)造成難以與天然淀粉酶區(qū)分的結(jié)果。蜂蜜中含有α-淀粉酶及少量的自身轉(zhuǎn)化酶，其中淀粉酶活性值的高低與蜂蜜的新鮮程度及蜂蜜營(yíng)養(yǎng)價(jià)值呈正相關(guān)，目前己有關(guān)于蜂蜜樣品中的α-淀粉酶與耐高溫α-淀粉酶酶學(xué)性質(zhì)及蛋白質(zhì)含量比較分析的報(bào)道:在所選的棗花蜜、油菜蜜、刺槐蜜樣品中，發(fā)現(xiàn)蜂蜜中淀粉酶的最適及最穩(wěn)定條件為溫度40C，pH5.3，在低溫條件下可長(zhǎng)期保持其酶值基本不變，但在高溫條件下，隨著儲(chǔ)存時(shí)間延長(zhǎng)，其酶值就會(huì)明顯下降；相比之下，耐高溫的α-淀粉酶的最適溫度為60C，最適pH值為6.0，且pH值不會(huì)隨著溫度變化而變化。由于蜂蜜中的淀粉酶是來(lái)源于蜜蜂身體的動(dòng)物淀粉酶，穩(wěn)定性較差，活性易受外界溫度影響，而蜂蜜摻假者為達(dá)到國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，會(huì)在產(chǎn)品中添加耐高溫的α-淀粉酶，所以通過(guò)測(cè)定酶學(xué)性質(zhì)可以區(qū)別真假蜂蜜。
花粉DNA條碼檢測(cè)
蜂蜜孢粉學(xué)(melissopalynology)是通過(guò)蜂蜜中的花粉及蜜源植物花粉形態(tài)來(lái)確定蜂蜜來(lái)源、產(chǎn)地和種類的科學(xué)。除上述2種基于蛋白質(zhì)差異的蜂蜜真?zhèn)舞b別研究外，近年來(lái)蜜源花粉DNA擴(kuò)増的DNA條碼也己開(kāi)始運(yùn)用于蜜源植物的鑒別研究中，如采用DNA條碼的方法描述蜜蜂采集的花粉特征，用放置在高山保護(hù)區(qū)3個(gè)區(qū)里的改良蜂箱收集花粉顆粒。DNA條碼的參考數(shù)據(jù)庫(kù)是從693種植物中收集的序列，GALIMBERTI等基于該數(shù)據(jù)庫(kù)識(shí)別從蜂箱采集的花粉，對(duì)其中的104種進(jìn)行了測(cè)序，在分子水平上確定了52種植物。該研究結(jié)果表明，花粉組成在很大程度上受植物區(qū)系生物多樣性、植物物候和外來(lái)開(kāi)花物種的影響。因此，基于DNA條碼的花粉分子特性或許有利于養(yǎng)蜂人獲得為市場(chǎng)需要的、具有特定營(yíng)養(yǎng)的蜂產(chǎn)品，為常規(guī)分析應(yīng)用提供了一種實(shí)用而有效的蜂蜜和蜂花粉DNA提取方法。但蜂蜜孢粉學(xué)分析在某些情況下必須輔以感官分析，此分析法對(duì)某些蜂蜜而言過(guò)程過(guò)于復(fù)雜，結(jié)果精確性難以保證。
結(jié)語(yǔ)
在與摻假行為的較量中，蜂蜜真?zhèn)螜z測(cè)技術(shù)一直處于下風(fēng)，原因主要有以下2點(diǎn)：
1) 檢測(cè)技術(shù)的開(kāi)發(fā)落后于摻假技術(shù)：目前檢測(cè)技術(shù)的目標(biāo)物通常是“摻假物”，當(dāng)摻假技術(shù)更新?lián)Q代，檢測(cè)技術(shù)需要一定的開(kāi)發(fā)和驗(yàn)證時(shí)間，這就造成了蜂蜜摻假監(jiān)管的“空窗期”，無(wú)法對(duì)新型摻假技術(shù)進(jìn)行預(yù)警和有效控制。在這段“空窗期”內(nèi)，蜂蜜摻假對(duì)消費(fèi)者帶來(lái)的食品安全風(fēng)險(xiǎn)會(huì)大幅度増加。
2) 摻假監(jiān)管成本過(guò)高:現(xiàn)代分析技術(shù)在一定程度上能夠有效鑒別蜂蜜真?zhèn)?，有利于蜂蜜質(zhì)量控制，但是所需儀器設(shè)備價(jià)格昂貴、操作技術(shù)復(fù)雜、檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、需要檢測(cè)人員有專業(yè)背景、操作地點(diǎn)固定，這些是現(xiàn)有分析技術(shù)普遍存在的缺點(diǎn)。同時(shí)，單一技術(shù)檢測(cè)范圍有限，無(wú)法保證結(jié)果的準(zhǔn)確性，需要分析化學(xué)、有機(jī)化學(xué)、生物學(xué)、波譜分析技術(shù)等多學(xué)科的交叉聯(lián)用，才能準(zhǔn)確判斷蜂蜜真?zhèn)巍Ｓ捎诂F(xiàn)有鑒別分析技術(shù)落后于摻假技術(shù)，造成蜂蜜摻假難以杜絕。
面對(duì)新的挑戰(zhàn)，制訂新的蜂蜜摻假檢測(cè)技術(shù)應(yīng)轉(zhuǎn)變思路，要從過(guò)去的“樣品中是否含有摻假物”轉(zhuǎn)變?yōu)椤皹悠分惺欠袢慷际欠涿邸?，后者即為目前?guó)際檢測(cè)界所推崇的真實(shí)性檢測(cè)(authenticity test)。實(shí)際上，理想的蜂蜜真?zhèn)舞b別方法應(yīng)準(zhǔn)確、快速、方便、價(jià)格便宜，并且無(wú)需進(jìn)行專業(yè)技術(shù)培訓(xùn)。針對(duì)現(xiàn)有鑒別技術(shù)缺陷和未來(lái)分析鑒別技術(shù)發(fā)展趨勢(shì)，應(yīng)重點(diǎn)針對(duì)蜂蜜特有真實(shí)性成分，改變長(zhǎng)期以來(lái)主要針對(duì)添加到蜂蜜中的外源物質(zhì)的策略。近20多年來(lái)，由于質(zhì)譜、高通量、免疫、生物信息學(xué)和生物統(tǒng)計(jì)學(xué)算法等技術(shù)的快速發(fā)展，基于基因組學(xué)、蛋白組學(xué)和代謝組學(xué)的生物標(biāo)志物的篩選和檢測(cè)技術(shù)己在生命科學(xué)、環(huán)境科學(xué)和醫(yī)療診斷領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。但迄今為止，國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)相關(guān)技術(shù)在蜂蜜真?zhèn)魏突坭b別領(lǐng)域應(yīng)用研究的報(bào)道，開(kāi)展基于蛋白組學(xué)等新興技術(shù)的真實(shí)性標(biāo)志物篩選和快速檢測(cè)技術(shù)研究，如基于膠體金免疫層析法(gold immuno chromatographic strip)的快速診斷試紙條，將是目前和未來(lái)蜂蜜真?zhèn)舞b別和檢測(cè)技術(shù)的潛在發(fā)展方向?？焖僭\斷試紙條的作用原理是滴加在膜一端的樣品溶液受膜的毛細(xì)管作用[基于層析作用的橫流(lateral flow)]向另一端移動(dòng)，在移動(dòng)過(guò)程中被分析物與固定在膜上某一區(qū)域的受體(抗原或者抗體)結(jié)合而被固相化，無(wú)關(guān)物質(zhì)則越過(guò)該區(qū)域而被分離，然后通過(guò)標(biāo)志物顯色來(lái)判定試驗(yàn)結(jié)果。它是一種快速、簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、無(wú)需儀器的方法，能在幾分鐘內(nèi)直觀地獲得檢測(cè)結(jié)果，這也是實(shí)現(xiàn)生物識(shí)別的理想生物學(xué)標(biāo)記法，并且目前在食品安全監(jiān)督、生物醫(yī)學(xué)、動(dòng)植物檢疫等領(lǐng)域都逐漸有所應(yīng)用，但在蜂蜜真實(shí)性檢測(cè)方面尚未有報(bào)道，未來(lái)可開(kāi)發(fā)應(yīng)用于蜂蜜真實(shí)性檢測(cè)的快速診斷試紙條。
責(zé)任編輯:曹原
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